指導教授—陳亦仁
中文摘要
研究動機與目的：主動脈瓣膜鈣化是一項常見疾病，但其細胞機制及其最佳治療用藥方法目前 仍缺乏明確的描述。以組蛋白乙醯轉移酶（histone acetyltransferase，HAT）進行附 基因調控在成骨細胞的轉分化與動脈硬化過程中扮演要角。此外，肝醣合成酶激 酶 3β（GSK-3β）和非典型無翅基因相關整合位點（wingless-related integration site， Wnt）訊息傳遞，在調控瓣膜間質細胞（valvular interstitial cell，VIC）鈣化的發病 機制上具有重要功用。本研究旨在探討 HAT 是否促進主動脈瓣膜鈣化之病理生理 現象，並評估抑制 HAT 的治療潛力；另一方面，我們探討組織蛋白去乙醯酶（histone deacetylases，HDACs）是否也在調控瓣膜間質細胞鈣化的病理生理中扮演角色。
重要研究方法：在 HAT 的研究中，我們將豬的瓣膜間質細胞（valvular interstitial cell，VIC） 以成骨培養基（osteogenic medium A，腫瘤壞死因子-α 10 ng/mL 與高磷酸鹽 4 mmol/L）處理 7 天後，分析肌纖維母細胞的 RNA 和蛋白質表現（α-SMA、波形蛋 白、1A1 型膠原蛋白、3 型膠原蛋白、Egr-1、MMP2、MMP9 等）以及瓣膜間質細 胞中的成骨細胞標記（骨鈣素與鹼性磷酸酶），並評估 p300 抑制劑（C646，10 μmol/L）對瓣膜間質細胞之鈣化（茜素紅染色測試）、成骨作用、HAT 活性、有絲 分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）與 Akt 路徑、克 洛素表現等的影響。 在 HDAC 的研究中，我們將豬的瓣膜間質細胞用傳統成骨培養基（osteogenic medium B）處理 5 天後，使用西方墨點法、即時聚合酶連鎖反應和增生檢測等方 法，分析成骨標記之表現、Wnt 訊息傳遞、骨成形蛋白（bone morphogenetic protein， BMP）訊息傳遞，並且分析單獨使用成骨培養基（osteogenic medium）或同時結合 HDAC 抑制劑進行處理的豬瓣膜間質細胞，其細胞增生情形。
研究結果：經成骨培養基 A 處理的瓣膜間質細胞在骨鈣素、鹼性磷酸酶、ac-H3K9 等的 表現比控制組強。C646 藉抑制 p300 的 HAT 活性降低瓣膜間質細胞的成骨作用。 成骨作用過程中 p300 蛋白質與 p300 的轉錄本皆未顯著增加。此外，成骨培養基 處理過的瓣膜間質細胞會降低克洛素的表現，而此作用會受到 C646 的弱化。 成骨培養基 B 培養 5 天的瓣膜間質細胞，比起對照組樣本，呈現出較高的 RUNX2 和 GSK-3β 表現。HDAC I 型抑制劑（1 μM 的 MS-275）降低了 RUNX2 的 mRNA、蛋白質表現強度、鹼性磷酸酶活性，也下調了非典型 Wnt/GSK-3β 訊 息傳遞、典型 Wnt/β-連環蛋白訊息傳遞以及 BMP 訊息傳遞。相對來說，結合 IIa、 IIb 型 HDAC 抑制劑（0.1 μM 的 MC1568 和 tubacin）提昇了 RUNX2 的表現。 MS-275、MC1568、tubacin 減少了瓣膜間質細胞增生，但減少的程度卻有差別。 在延長培養時間（14 天）的成骨培養基Ｂ培養的瓣膜間質細胞中，MS-275 降低了 RUNX2 和骨鈣素的表現。
結論：活化 p300 的 HAT 活性可以透過克洛素調控的瓣膜間質細胞的成骨細胞轉分 化，來調控主動脈瓣膜的鈣化。抑制 p300 為主動脈瓣膜鈣化的潛在治療目標。藉 由典型和非典型 Wnt 訊息傳遞路徑，第一型 HDAC 抑制劑 MS-275 可大幅調整瓣 膜間質細胞中 RUNX2 的轉活化，進一步減少主動脈瓣膜的鈣化。
關鍵字：鈣化性主動脈瓣膜疾病、β-連環蛋白（β-catenin）、肝醣合成酶激酶 3β （GSK-3β）、克洛素、MS-275、p300、RUNX2、瓣膜間質細胞、無翅基因相關整 合位點（Wnt）